龟分枝杆菌是一种快速生长的非结核分枝杆菌，是免疫功能低下宿主发生慢性感染的罕见病因。这种生物在环境中普遍存在，临床上最常表现为局部皮肤或软组织感染或播散性皮肤疾病。
医院感染可能发生在整形手术或暴露于受污染的设备或物质之后，无论是在医疗机构还是在纹身店等社区环境中。弥散性皮肤病最常见于免疫抑制患者，包括接受实体器官移植或接受皮质类固醇或免疫疗法治疗的自身免疫性疾病患者。与脓肿分枝杆菌(以广泛的抗菌素耐药性而闻名)等其他分枝杆菌种类类似，龟分枝杆菌也被证明具有多药耐药性。
耐多药龟分枝杆菌感染对治疗提出了挑战，延长抗菌疗程会导致明显的毒性和进一步的耐药性。我们报道了一例难治性皮肤播散性龟分枝杆菌感染的临床病程，使用托法替尼联合抗菌，手术和单一噬菌体治疗，临床疗效良好。患者产生了抗噬菌体的中和抗体，但活检呈阴性，病情持续稳定改善，没有证据表明细菌对噬菌体有耐药性。
一名56岁的男性于2020年1月到皮肤科诊所就诊，他的左上肢出现了新的结节性病变，体重减轻、盗汗、肌痛和疲劳。
2019年诊断为双侧手、手腕、膝盖和脚踝的血清阴性关节炎。他接受了多种关节炎免疫疗法，包括甲氨蝶呤、依那西普、阿达木单抗和最近的托法替尼，自2019年11月以来，疗效甚微。 他还接受了多个疗程的强的松(肾上腺皮质激素)，每天最多40毫克。
在临床中，他描述了几个月的左上肢结节性病变，并伴有间歇性自发引流(图1A-B)。用分枝杆菌培养物进行活组织检查。病理染色显示分枝杆菌丰富，炎性细胞密集浸润及坏死。
图1 龟分枝杆菌感染的临床病程。A：左上肢多发大红斑、波动至结节性病变，最终诊断为皮肤播散性龟分枝杆菌感染。B：在增加噬菌体治疗之前(2020年12月)和之后(2021年8月)的左上肢病变图像。C：在加入噬菌体治疗之前(2021年3月)和之后(2021年8月)进行PET/CT。
患者的抗菌治疗过程的特点是，一系列严重的毒性导致治疗方法的改变(图2)。患者于2020年1月23日开始口服阿奇霉素、口服甲氧苄啶-磺胺甲恶唑(TMP/SMX)和口服妥布霉素治疗。
他的病程因2月底住院而复杂化，症状恶化被认为是由于免疫重建强的松减量时的炎症综合征。他还出现了多种药物毒性，包括妥布霉素引起的肾损伤和耳毒性，以及TMP/SMX引起的胃肠道症状，导致一段时间的阿奇霉素单药治疗和后续耐药的发展。
在随后的几个月里，他接受了几种新的抗菌药物治疗，包括替地唑胺、奥玛环素等，这些药物受到毒性或耐药性的限制，如图2所示。尽管努力优化了抗菌方案，但在2020年5月、8月和10月，他仍有持续的皮肤病变，分枝杆菌培养呈阳性，病理染色呈阳性。
在2020年6月，他在脐周皮下组织和右下肢出现了新的病变，表明播散性皮肤感染。正电子发射断层扫描/计算机断层扫描(PET/CT)显示没有内脏部位的疾病(图1C)，但存在免疫失调和家族性自身炎症性疾病。
图 2 龟分枝杆菌感染的治疗。2020年1月至2021年12月龟分枝杆菌感染的抗菌素和噬菌体管理时间表
2020年12月，他出现了严重的左手腕疼痛，并被发现患有感染性左手腕关节炎。他于2020年12月14日接受了左手腕滑膜切除术，冲洗和清创术，并对其最活跃的皮肤病变进行了除肿。
他接受了美洛哌烯-沃巴坦、TMP/SMX、奥玛德环素、氯法齐明和贝达喹啉5药方案的再诱导，为期一个月，然后过渡到奥玛德环素、氯法齐明和贝达喹啉3药方案。继续采用这种方案，直到2021年2月，当时他出现恶化的结节性和波动性病变，重复活检显示有大量分枝杆菌的红肿性真皮脓肿。
鉴于他的难治性感染，患者被确定为噬菌体治疗的潜在候选人。从2020年10月开始分离的龟分枝杆菌(指定菌株GD153)用于筛选潜在的治疗噬菌体。GD153对一组约20种耻垢分枝杆菌噬菌体的敏感性进行了测试，这些噬菌体先前已显示出对抗脓肿分岐杆菌感染的潜在活性(图3A)，以及9个由溶原脓肿分枝杆菌临床分离株诱导的裂解噬菌体(图3 B)。
单一噬菌体Muddy(及其宿主范围变体Muddy_HRMGD04)有效地感染GD153(图3A中3、4)，在噬菌体以10个感染倍数挑战4个×108细胞后，没有明显的存活(图3C)。在较宽的细菌和噬菌体浓度范围内，Muddy也能很好地杀死龟分枝杆菌GD153(图3D)。
图 3治疗龟分枝杆菌的噬菌体。A：在M. smegmatis mc2155和M. chelonae GD153的琼脂覆盖层上每个噬菌体(左)的10倍连续稀释。Phages: 3(Muddy);4(Muddy_HRMGD04)B：龟分枝杆菌GD153和对照菌株脓肿分枝杆菌GD40上脓肿分枝杆菌裂解诱导的前噬菌体。C ：在液体培养感染后，Muddy对M. chelonae GD153的杀灭(MOI=10); -Muddy：无噬菌体对照。D：在细菌和噬菌体浓度范围内有效杀灭龟分枝杆菌GD153。所有排含有10倍连续稀释的细菌培养物。上一行(-)，无噬菌体对照;第2-9行，10倍连续稀释，第2行为1010 PFU。E：噬菌体治疗开始后3天、17天或16周血清中抗Muddy IgG抗体的ELISA反应。F：从ELISA曲线中得到的最大IgG滴度的一半拟合在图D中。 G：为了检测抗体中和，在噬菌体开始使用2天、3天、17天或16周后，将Muddy与血浆(p)或血清(s)孵育2小时(上)或24小时(下)，然后在M. smegmatis mc2155的琼脂覆盖层上连续稀释10倍。
Muddy具有虹吸病毒形态，生长良好，滴度高，稳定，有效杀死结核分枝杆菌，并已用于治疗脓肿分枝杆菌感染。患者于2021年6月15日开始每天两次静脉注射噬菌体治疗，每剂Muddy的剂量为109个单位(pfu)，并与他之前的抗细菌治疗结合。注射噬菌体2小时后，患者出现寒战和恶心，无其他相关症状或生命体征变化。这些情况在没有干预的情况下得到解决。他在2021年6月18日出院后接受了检查和每周实验室检测，包括基本代谢小组、肝功能测试和不同的全血细胞计数，没有任何不良反应的报告，实验室标志物稳定。
患者的皮损在治疗的前两周内明显改善，并在随后的几个月里继续稳步改善，炎症和结节减少(图1B)。小皮下结节持续存在，因此在2021年8月和11月进行了重复活检，在组织病理学上没有显示肉芽肿或抗酸杆菌(AFB)的证据，组织培养为阴性。
在开始使用噬菌体后第3天和第17天以及第16周的血清中检测了针对Muddy的抗体(图3E, F)。第3天的样本显示了弱但特异性的IgG反应，这可能早于噬菌体使用之前就已经存在，但在噬菌体开始使用后的第17天和第16周，都出现了强有力的IgG介导的反应，与之前报道的患者的反应相当。抗体在第17天的反应是轻度中和，但在第16周的反应更为强烈(图3G)。这些抗体反应并没有否定患者的整体临床改善。由于病情明显好转且无不良反应，患者继续静脉注射噬菌体治疗。
噬菌体是在环境中普遍存在的生物，具有感染和杀死细菌宿主的能力。使用多种噬菌体分离株鸡尾酒的噬菌体治疗最近已成功用于耐药细菌感染的治疗，包括与传统抗生素治疗联合使用的耐多药非结核分枝杆菌感染。
在这里，我们描述了一种新颖的治疗方法，患者的皮肤播散性龟分枝杆菌感染与单一噬菌体，结合抗生素和手术管理。虽然他此前接受了广泛的抗微生物药物治疗，并于2020年12月进行了手术清创，但他的皮损和活检仍呈阳性，染色上有坏死性肉芽肿和大量分枝杆菌的证据。在开始噬菌体治疗后，皮肤病变在检查和PET/CT扫描上均有显著改善。治疗后2个月和5个月的两次活检显示，在组织病理学上没有肉芽肿或AFB的证据，组织培养仍为阴性。患者没有发生与噬菌体治疗相关的不良事件，并已成功地在家中静脉注射长达6个月。
噬菌体治疗的一个潜在的主要限制是噬菌体抗性的发展，可以使用适当设计的噬菌体鸡尾酒来应对。 在这里，我们仅限于一种噬菌体，因为没有其他噬菌体对患者的龟分枝杆菌菌株具有高度活性。虽然可能发生对Muddy的耐药，但在体外未检测到，这与脓肿分枝杆菌分离株中很少出现噬菌体耐药一致。此外，未观察到体内噬菌体耐药性导致治疗效果丧失。
用噬菌体疗法成功治疗细菌感染的第二个障碍是宿主免疫系统和噬菌体之间复杂的相互作用。在我们的病例中，尽管发现了对噬菌体的中和抗体反应，但患者的病情稳定改善，微生物学和组织病理学研究呈阴性。噬菌体的作用可能是迅速减轻感染负担，从而改善了以前不足的持续抗菌治疗的控制。
据我们所知，这是第一例用噬菌体治疗人类龟分枝杆菌感染的病例，也是第一例用单一噬菌体治疗分枝杆菌感染的病例。噬菌体治疗是多药耐药感染的一种有前途的治疗选择，但对安全性、细菌耐药发展的驱动因素以及抗体介导的噬菌体中和的临床意义的了解的提高对推进这种治疗至关重要 。
期刊信息：IF：17.694
中科院分区：综合性期刊1区
卷：13，期：1，号：2313
DOI：10.1038/s41467-022-29689-4